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试验方法芯片分离检验

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试验方法芯片分离检验

发布日期:2015-09-02 00:00 来源: 点击:

1试验部分1.1试验仪器与试剂十字通道的玻璃芯片按文献[9]的方法制备,分离通道总长4.4cm(从十字交叉口到检测点的有效长度为2.9cm),试样通道长0.9cm;自制共聚焦激光荧光检测系统[10];激发波长为473nm的MBL10型半导体激光器。
  芯片毛细管电泳快速分离检测黄素单核苷酸合成品中的核黄素微流控玻璃芯片的结构示意图Fig.1SchematicdiagramoftheglassmicrofluidicchipB―――缓冲液池(Reserviorforbuffer)S―――试样池(Reserviorforsample)BW―――废液池(Reserviorforwaste)LIF―――激光诱导荧光检测(LIFdetection)SW―――试样废液池(Reserviorforsamplewaste)RF2540荧光分光光度计核黄素和黄素单核苷酸钠为Sigma产品,其余试剂均为分析纯试剂。
  核黄素和黄素单核苷酸钠储备液:100μmol
  L-1,用pH7.0的5.0mmolL-1磷酸溶液配制后,避光储存在冰箱中。每次试验前用电泳缓冲液稀释至所需浓度,并经0.25μm微孔滤膜过滤。
  1.2试验方法芯片使用前依次用0.1mol?L-1氢氧化钠、水和5.0mmol?L-1磷酸缓冲溶液清洗通道各20min.向芯片缓冲液池、废液池和试样废液池加入分离缓冲液,向试样池中加入试样溶液后,将芯片置于激光荧光检测器工作台,微光测量仪的负高压调至-450V,对准光路,将四路高压电源的铂电极分别插入四个储液池,开启高压电源,按设定的电压程序实施充样2分离操作,在记录仪上记录电泳谱图。
  2结果与讨论2.1RF和FMN的荧光光谱特性在荧光光谱仪上绘制RF和FMN(pH7.0的5.0mmol?L-1磷酸缓冲溶液为介质)的激发光谱和发射光谱,两者的光谱十分相似,λex和λem分别在465nm和523nm附近,与激光荧光检测系统的激发波长(473nm)和检测波长(520nm)接近。在相同浓度下,RF的荧光强度约是FMN的两倍。
  2.2进样本文采用十字通道夹流进样[6,11]方式,采用四路高压电源,在缓冲液池、废液池、试样池和试样废液池上所加的电压分别表示为V1、V2、V3和V4(见图3)。充样时V4=0,调节V1、V2和V3,使各通道(a)(b)图2RF和FMN的激发光谱图(a)和荧光光谱图(b)ig.2ExcitationspectraandfluorescencespectraofRFandFMN中的电渗流方向如图3(a)中的箭头所示。在电场的作用下,试样带在十字交叉口被夹成三角形,从而抑制充样时试样从十字交叉口向分离通道扩散而造成谱带扩张。充样一定时间后,电压切换使V2=0,调节V1、V3和V4,使电渗流方向所示,在十字交叉口的三角形试样带被电泳缓冲液推入分离通道,开始电泳分离,同时两侧充样通道中的试样溶液被反拉入试样池和试样废液池,以避免分离时试样溶液从试样通道漏入分离通道而使基线漂移。
  (a)充样(b)进样2分离(Samplefilling)(Sampleinjection2separation)芯片十字通道的夹流进样过程Fig.3Processofpinch2injectionatthecrosschannel为了确定合适的充样和分离电压,一般可先用强荧光物质(如荧光素钠)作为指示剂加入试样液池S,在显微镜下观察夹流和反拉时十字交叉口处的试样带形状[12],调节各路电压,以得到初步的夹流效果。然后,再将S液池中的指示剂替换为试样溶液,采用LIF检测,优化充样和分离电压。这样分两步优化往往可以达到事半功倍的效果。本文经优化后的充样2分离电压操作程序见表1.
  2.3分离电压的选择分离电压是影响柱效、分离度和分析时间的主要试验参数。在所试验的电压范围内,电压芯片毛细管电泳快速分离检测黄素单核苷酸合成品中的核黄素表1充样和分离的电压程序Tab.1Voltageprogramofsample2fillingandseparation功能Function时间Time(t/s)施加于各液池的电压VoltageappliedtothereserviorsV1V2V3V4充样2065075010000进样2分离60250002000图4分离电压的影响Fig.4Effectofseparationvoltages1,2.
  分别为RF和FMN的分离电压2迁移时间曲线(Curves1,2ofmigrationtimeagaintseparationvoltageforRFandFMNrespectively)3.RF的分离电压2塔板数曲线(Curve3ofnumberofcolumnplateofRFagaintseparationvoltage)5.0mmol
  L-1磷酸缓冲液(pH6.00)(5mmol
  L-1Phosphatebuffer,pH6.00)RF:10μmol
  L-1,FMN:15μmol
  L-1越高,组分的迁移时间越短,柱效越高。考虑到分离对象较为简单,在2500V时,两组分的分离度已达到最佳,选择分离电压为2500V.同时按80的比例在试样池和试样废液池施加2000V的反拉电压,防止试样溶液的泄漏。
  2.4分离缓冲液酸度和浓度的选择电泳缓冲液的pH在6~8范围内变化,RF的迁移时间几乎不变,而FMN随pH升高而迁移时间逐步变长,但在所试验的pH范围内,两组分都能达到基线分离。考虑到RF溶液在碱性溶液中不稳定,选择pH7.0的磷酸缓冲溶液作为分离介质。
  分离缓冲液浓度对分离有较大影响,随着浓度的提高(2.5~12.5mmol?L-1),两组分的迁移时间逐步增长,峰高逐步降低。但缓冲液浓度为2.5mmol?L-1时,RF和FMN没有达到基线分离。选择5.0mmol?L-1(pH7.0)的磷酸溶液作为电泳分离的缓冲溶液。在此条件下,一次完成分离分析的时间约为1min.
  2.5应用应用已优化的条件,分离检测了FMN(钠盐)合成品(纯度>85)中的RF杂质,如图5.经与标准物的电泳峰对照,FMN(钠盐)合成品中的RF杂质含量约为3左右,符合产品规格。

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